Для морфологического подтверждения туберкулеза, как и для любого инфекционного процесса, важным моментом является выявление инфекционного агента (возбудителя заболевания) в гистологических препаратах.

Гистобактериоскопия по Цилю-Нильсену - наиболее распространенный метод, позволяющий выявить микроорганизмы семейства кислото- и спиртоустойчивых, к которым относятся возбудители туберкулеза. Кислотоустойчивость обусловлена особенностями химического состава клеточной стенки микобактерий с наличием в составе гетерогенной смеси высокомолекулярных липополисахаридов. Это обеспечивает микроорганизму резистентность о отношению к разнообразным неблагоприятным факторам окружающей среды. Метод основан на способности микроорганизмов оставаться окрашенными после воздействия спирто- и кислотосодержащими реактивами, что обеспечивается проникновением карболового фуксина в микробную клетку через мембрану при одновременном воздействии нагревания и фенола. Последующее обесцвечивание гистологического среза ткани (или цитологического препарата) солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур, которые докрашивают затем раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и ядра клеток - в синий цвет, общий фон препарата - голубого цвета.

Люминесцентная микроскопия с окраской флюоресцентными красителями (аурамином и родамином) - более чувствительный метод для выявления кислотоустойчивых бактерий. При люминесцентной микроскопии бактерии, окрашенные специальными красителями (флюорохромами), под действием ультрафиолетового облучения испускают излучение в видимом спектре света. Данная окраска, являясь высококонтрастной, позволяет выявлять не только классические палочки Коха, но и так называемые «атипичные формы» микобактерий, потерявших часть компонентов клеточной стенки и демонстрирующих очень слабую кислотоустойчивость при окраске по Цилю-Нильсену. Для улучшения проникновения красителя внутрь микобактерий используется аналогичный способ обработки с нагреванием и включением в состав красящего раствора карболовой кислоты. С учётом того, что некоторые компоненты клеток (каротиноиды, коллаген, эластин и пр.) способны к аутофлуоресценции, производится обесцвечивание фона с использованием перманганата калия. Люминесцентные красители (аурамин ОО, родамин С и др.) связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. Для исследования микропрепаратов требуется использование флуоресцентного микроскопа. При облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света (определенный спектр ультрафиолетового излучения) они начинают светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или темно-зеленом фоне. За счет свечения формируется перицеллюлярный ореол, что оптически увеличивает размеры светящейся клетки, что позволяет исследовать окрашенные флюорохромными красителями препараты при увеличении Х250 - Х450 (окрашенные по Цилю-Нильсену - при увеличении Х800 - Х1000) и сократить время просмотра препарата. Кроме того, при люминесцентной микроскопии отмечается большая резкость и контрастность микроскопической картины, что повышает комфортность микроскопического исследования, что делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала (РИС люм).

Иммуногистохими́ческое иссле́дование позволяет определить род возбудителя (микобактерии)  — это иммуноморфологический метод микроскопического исследования
тканей , основанный на обработке срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном (в частности, антигеном являются микобактерии). При проведении реакции между антигеном и вводимыми антителами формируется комплекс антиген-антитело, который визуализируется при окрашивании специальным хромогеном. Специфичность и чувствительность этого метода достаточно высоки, однако есть и отрицательные стороны при выявлении микобактерий: антитела к туберкулёзным микобактериям представлены на рынке в ограниченном количестве; всегда демонстрируют высокую чувствительность; большое количество артефициальных микроструктур в срезе, сходных с микобактериями; перекрёстная чувствительность ряда антител как к микобактериями туберкулёзного комплекса (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti), так и к нетуберкулёзным микобактериям (РИС игх).

Видовую идентификацию отдельных микобактерий проводят с помощью исследования фрагмента ткани из парафинового блока методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Экстракт ДНК получают из выбранных для исследования участков парафинового блока с кусочком ткани посредством удаления парафина ксилолом, с дальнейшим центрифугированием, извлечением из ткани ДНК, и обработки до пригодного для исследования физического и химического состояния. Эффективность метода является высокой за счет практически 100% специфичности, однако в связи с химической и термической обработкой материала в процессе проводки и формирования парафинового блока с фрагментом ткани, происходит необратимая потеря нуклеиновых кислот (свыше 90% РНК и не менее 75% ДНК), с разрывом их цепей, уменьшением размера пригодных к исследованию последовательностей (большей частью повреждаются краевые последовательности в сравнении с центральной частью молекулы), появлением артефициальных мутаций. Кроме того, сохранность фрагментов ДНК снижается при хранении парафиновых блоков более года. В целом, пригодными для исследования считаются фрагменты нуклеиновых кислот, насчитывающие не менее 100 пар нуклеотидов. С целью увеличения размера амплифицируемых фрагментов нуклеиновых кислот используются различные приёмы (инкубация с taq-полимеразами и К-протеиназами, замена формалина на жидкость Карнуа, использование щадящих по отношению к ткани протоколов, инактивация К-протеиназы, эндогенной щелочной фосфатазы и др.). Несмотря на вышеуказанное, метод ПЦР позволяет выявлять ДНК МБТ даже при низкой бактериальной нагрузке ткани, определять лекарственную чувствительность к ряду основных противотуберкулезных препаратов, идентифицировать вакцинный штамм BCG, определять ДНК M. avium complex (MAC) (РИС ПЦР).

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) - метод основан на возможности путем сканирования получать послойное изображение препарата с контрастированием внутренних структур, при этом оптическая система формирует светящееся пятно на заданной глубине микрообъекта. При этом обеспечивется визуализация изображения, трёхмерная реконструкция объекта, различные виды анализа внутриклеточных структур, межклеточных взаимодействий, возможность концентрационных измерений в компартментах клетки, измерений проницаемости мембранных структур и др. С помощью КЛСМ в гистологических препаратах легочной ткани больных туберкулезом, обработанной поликлональными антителами против MБT, выявляются как колонии, так и одиночные MБT, локализованные внутри- и внеклеточно в очагах казеозного некроза и в перифокальной области. Регистрация спектров испускания позволяет отфильтровать специфический сигнал от неспецифической флуоресценции в препаратах. Автоматический захват изображений больших объемов ткани с построением трехмерного изображения обеспечивает проведение автоматизированного поиска и подсчет MБT в ткани. (РИС КЛСМ).